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蛋白提取和SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒说明书
点击次数:3261 发布时间:2015/11/27 16:08:27
蛋白提取和SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒说明书

一、产品简介
蛋白提取和SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒包含了蛋白提取试剂及SDS-PAGE凝胶电泳所需的试剂。其中包括RIPA裂解液,BCA蛋白定量试剂,5×蛋白上样buffer,预染的蛋白Marker和 SDS-PAGE凝胶电泳试剂。
RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的主要成分为50mM Tris (pH 7.4),150mM NaCl,1% Triton X-100,1% sodium deoxycholate,0.1% SDS,以及sodium orthovanadate,sodium fluoride,EDTA,leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。
BCA蛋白浓度测定试剂最常用的两种蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成,实现了蛋白浓度测定的简单,高稳定性,高灵敏度和高兼容性。BCA法测定蛋白浓度灵敏度高,检测浓度下限达到25µg/ml,最小检测蛋白量达到0.5µg,待测样品体积为1-20µl。在50-2000µg/ml浓度范围内有较好的线性关系。
SDS-PAGE凝胶配制试剂提供了配制SDS-PAGE凝胶所需的各种试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,即可配制PAGE胶了。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE凝胶,也可用于配制非变性(native)PAGE凝胶。本试剂盒约可配制25块常规大小的PAGE胶(即聚丙烯酰胺凝胶)。
应用方面:可用于Western Blotting中的蛋白提取和电泳的全过程。

二、试剂盒组份

   

 25 assay

储存温度

RIPA裂解液(强)

25ml

-20℃

BCA定量试剂

 

蛋白标准溶液(0. 5 μg/μL 

5 mL

-20

BCA试剂A

25 mL×2

4

BCA试剂B

1mL

4

 

 

 

5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液               

1 ml

-20℃

预染蛋白分子量 Marker14.4-116KD

125μL

-20℃


 

三、试剂盒以外自备仪器和试剂

手术剪,玻璃匀浆器,细胞刮,摇床,eppendorf管,涡旋振荡器,微型高速冷冻离心机,分光光度计或酶标仪,酶标板,电泳装置,1.5m L离心管,100mMPMSF,冰冷PBS,去离子水

四、保存条件:

RIPA裂解液(强),5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,预染蛋白分子量 Marker(14.4-116KD)-20℃保存

蛋白标准溶液-20℃保存,BCA试剂A和BCA试剂B室温保存。

1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温或4℃保存。30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。

过硫酸铵配制成10%溶液后(0.5g中加入4.5ml蒸馏水溶解),分装成小管-20℃保存,通常半年内有效。

 五、      操作规程

(1)用RIPA裂解液提取蛋白

注意事项:

1、   为取得最佳的使用效果,尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。

2、   需自备PMSF。

3、   裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

4、   有的样本要通过一些预实验来摸索最佳的适合您实验条件的裂解液。

5、   一般常规提取的蛋白样品,进行后续试验不需要透析,但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想,则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐,建议使用透析液透析后进行后续分析。

6、   为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。蛋白提取和SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒说明书

(一)        对于细胞

1、   RIPA裂解液(强)工作液的准备

 在每mL 冷RIPA裂解液(强)加入10μL 100mM PMSF混匀。冰上保存数分钟待用。

2、   样品的处理

A、  悬浮细胞

a、    离心(2000rpm,5min)收集细胞,尽最大努力吸尽上清。

b、  用PBS洗一遍,离心(2000rpm,5min)吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

c、    转入第3步进行操作。

B、  贴壁细胞

a、    培养好的细胞吸去培养基后,加入10mL冷PBS洗两次,每次振摇数次以尽量去除培养液。

b、   用细胞刮子刮下细胞,或用EDTA溶液(不含胰酶)处理细胞使细胞不再贴壁很紧,并用移液器吹打下细胞。

c、    将细胞溶液转至新的冰冷离心管中,离心(2000rpm,5min)吸尽上清。

d、  用PBS洗一遍,离心(2000rpm,5min)吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

e、    转入第3步进行操作。

3、   加入上述配制好的冷RIPA裂解液(强)工作液加入量如下表所示:

   细胞数量

培养板或培养瓶的规格

WesternIP细胞裂解液加入量

107

100mm培养板或150cm2培养瓶

1 mL2 mL

5×106

60mm培养板或75cm2培养瓶

0.5 mL1 mL


4、   置于4℃摇床平台上,温和振荡15 min。

5、   离心(12,000rpm,4℃)15min,取上清为蛋白提取物,蛋白定量(建议用BCA法)。蛋白提取和SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒说明书

6、   分装保存于-70℃,避免反复冻融。

(二)、新鲜组织

1、   RIPA裂解液(强)工作液的准备

在每mL 冷RIPA裂解液(强)工作液加入10μL 100mM PMSF混匀。冰上保存数分钟待用。

2、   称取100 mg左右的新鲜组织如肝脏、脑、心肌等,PBS或生理盐水冲洗,洗净血水,滤纸吸干。

3、   把组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中,用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片。

4、   加入0.5~1 mL冰预冷的RIPA裂解液(强)工作液,0℃冰浴上下研磨组织20次。

5、   取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管,冰浴放置15min。

6、   离心(12,000rpm,4℃)15min,取上清为蛋白提取物,蛋白定量(建议用BCA法)。

7、    分装保存于-70℃,避免反复冻融。

(2)        用BCA蛋白定量试剂测定蛋白的浓度

注意事项:

1、   BCA试剂A 和BCA试剂B使用前请颠倒3-5次,混匀。

2、   配制好的混合BCA工作液室温24小时内稳定。

3、   加入BCA工作液后,也可以在室温放置2小时,或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低,适合在较高温度孵育,或延长孵育时间。

4、   蛋白标准请在全部溶解后先混匀,再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。

5、   需酶标仪一台,测定波长为540-595nm之间,562nm最佳。并需96孔板。

6、   比色应在2h内完成。

7、   为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

A、  普通分光光度计操作 

1、     估计样品蛋白的浓度范围,并将样品稀释至合适浓度。

2、   BCA工作液的准备:

根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。

3、取若干个带盖的1.5 mL离心管,编好号后,按下表加入试剂:
 

 

孔号

0

1

2

3

4

5

6

7

8(…样品)

蛋白标准溶液(μL

0

1

2

4

8

12

16

20

0

去离子水(μL

20

19

18

16

12

8

4

0

20X

样品(μL

0

0

0

0

0

0

0

0

X

BCA工作液(μL

200

200

200

200

200

200

200

200

200

对应蛋白含量(μg

0

0.5

1.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

 

  

 

 

 

 

 

4把酶标板放在振荡器上振荡30sec37℃放置30分钟再次振荡,然后以0号孔在562nm下用酶标仪进行比色测定。记录各孔的吸光值。根据孔号1234567的吸光值以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。

5   根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含量(μg),除以加入样品的体积(XμL),乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度。

3        蛋白变性

注意事项:

1     5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中含少量DTT和巯基乙醇,有轻微刺激性气味。

2     5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液必须完全溶解后再使用。

3     为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

蛋白变性步骤

1      在室温或不超过37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上样缓冲液(5X)。水浴溶解后立即室温存放,尽量避免长时间置于水浴中。

2      按照每4微升蛋白样品加入1微升5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液的比例,充分混合。

3      00℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。

4      置冰上5分钟,10000rpm离心1分钟,取上清直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

4        配制SDS-PAGE凝胶

注意事项:

1      TEMED宜避光保存。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切,可通过适当调节TEMED的用量,

控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。

2 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

配制SDS-PAGE凝胶过程

1 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分   

离胶(即下层胶)

不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围:

SDS-PAGE分离胶浓度

最佳分离范围

6%

50-150kD

8%

30-90kD

10%

20-80kD

12%

12-60kD

15%

20kD以下

2              按照下面的配方进行配制(总体积为15ml),如有体积变动可按比例进行放大或缩小。

贮液(ml

分离胶中丙烯酰胺的终浓度(%

 

6

8

10

12

15

蒸馏水

6.0

5.0

4.0

3.0

1.5

30% Acr-Bis291

3.0

4.0

5.0

6.0

7.5

1M Tris-HCl, pH8.8

5.7

5.7

5.7

5.7

5.7

10% SDS

0.15

0.15

0.15

0.15

0.15

10%的过硫酸铵

0.15

0.15

0.15

0.15

0.15

TEMED

0.01

0.01

0.01

0.01

0.01

 

 

 

 

 

  3、按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)

成分

配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升)

5%

2

3

4

6

8

10

蒸馏水

1.4

2.1

2.7

4.1

5.5

6.8

30% Acr-Bis291

0.33

0.5

0.67

1.0

1.3

1.7

1M Tris-HCl, pH6.8

0.25

0.38

0.5

0.75

1.0

1.25

10% SDS

0.02

0.03

0.04

0.06

0.08

0.1

10%的过硫酸铵

0.02

0.03

0.04

0.06

0.08

0.1

TEMED

0.002

0.003

0.004

0.006

0.008

0.01

5        电泳

    配好的凝胶装入电泳槽,配制一定体积的1×Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液。变性好的样品按照一定的顺序加入电泳泳道,同时预染蛋白也加入电泳泳道。浓缩胶电泳时的条件为4V/cm,分离胶电泳时的条件为8V/cm

 

 

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